Artigos Técnicos

Boas Práticas de Laboratório Microbiológico na Indústria Farmacêutica
 
UNIFAR
São Paulo, 03 de fevereiro de 2018
Miriam de Faria Lemos
 
Miriam Lemos
Microbiologista

 
- Mestre em Microbiologia pelo Instituto de Ciências Biomédicas da USP.
- Especialização em Biotecnologia e Biologia Molecular na Universidade deParis – França.
- Bacharel e licenciada em Ciências Biológicas pela Universidade de São Paulo
- Experiência em Biodeterioração de materiais, tendo atuado como coordenadora de Laboratório de Microbiologia em diferentes áreas, como tintas e revestimentos, cosméticos, desinfecção, petróleo, tratamento de águas, entre outras. Participou de grupo de Microbiologia da ABNT Tintas e foi membro do IBRG (International Biodeterioration Research Group).
- Coordenou Fórum Ambiental para área de Petróleo.
- Experiência em Biotecnologia, especificamente na área de microrganismos produtores de antibióticos.
- Controle de Qualidade Microbiológico em indáustria farmacêutica e química
- Atualmente ministra treinamentos, dá consultorias e assessoria emmicrobiologia industrial
 
Por que nunca dá tempopara fazer certo... mas sempre dá tempo para refazer?

Apresentação: documento base
World Health Organization - WHO Technical Report Series, No. 961, 2011 - Annex 2 - WHO good practices for pharmaceutical microbiology laboratories.

Introdução e escopo

Laboratórios de microbiologia na indústria farmacêutica podem estar envolvidos em:
- teste de esterilidade.
- detecção, isolamento, enumeração e identificação de microrganismos (bactérias, leveduras e bolores), testes para endotoxinas bacterianas em diferentes materiais (matéria prima, água), produtos, superfícies, vestuário emeio ambiente.
- ensaios utilizando microrganismos como parte do sistema de teste.

Boas Práticas para Laboratórios de Microbiologia na Indústria Farmacêutica (OMS)

Essas diretrizes dizem respeito a todos os laboratórios de microbiologia envolvidos nas atividades de teste acima mencionadas, sejam eles independentes ou departamento ou unidade de uma indústria farmacêutica.

Diretrizes baseadas em e suplementam os requerimentos de:

- Good Practices for pharmaceutical quality control laboratories. In: WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Forty fourth report. Geneva, World Health Organization. WHO Technical Report Series, No. 957, 2010, Annex 1.
- General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances. Revision. In: WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Forty-fi rst report. Geneva, World Health Organization. WHO Technical Report Series, No. 943, 2007,
02/02A/20n18nex 3.
- The International Pharmacopoeia, Fourth Edition. Geneva, World Health Organization, 2006. 
- The International Pharmacopoeia, Fourth Edition, First Supplement. Geneva, World Health Organization, 2008. 
- ISO/IEC 17025 (2005) General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.

Aspectos considerados:

- Pessoal 
- Ambiente
- Validação de Métodos
- Equipamentos
- Reagentes e meios de Cultura
- Materiais de Referência e Culturas referência
- Amostragem
- Manipulação e identificação das amostras
- Descarte de resíduos contaminados
- Garantia da qualidade dos resultados e controle de qualidade
- Procedimentos Analíticos
- Relatórios

Pessoal

- Os testes microbiológicos devem ser realizados e supervisionados por um pessoa experiente, qualificada em microbiologia ou equivalente. 
- O pessoal deve ter treinamento básico em microbiologia e experiência prática relevante antes de ser permitido realizar trabalhos incluídos pelo escopo de testes.

Alguns pontos importantes...

- Descrição das funções.
- O laboratório também deve manter registros de todo o pessoal técnico, descrevendo suas qualificações, treinamento e experiência.
- Opiniões e interpretação de resultados de testes.
- Âmbito do treinamento.
- Bio segurança: contenção e manipulação segura.

Ambiente

- O Laboratório de Microbiologia deve ser dedicado e separado de outros ambientes (incluindo equipamentos e vidraria).
- Deve ser projetado de acordo com as atividades ali desenvolvidas.
- Espaço suficiente e adequado (evitar contaminação, contaminação cruzada e disseminação de contaminantes)
- Material adequado (resistente à limpeza e procedimentos de desinfecção).
- Atividades em áreas separadas (sem possibilidade de retorno).
- Separação física ou temporal.
   - Controle da qualidade do ar, umidade, etc.
   - Acesso restrito.
- Classificação das áreas.
   - Monitoramento ambiental.
- Higiene: limpeza e desinfecção.
- Instalações para testes de esterilidade.

Apêndice 1:Exemplos de áreas (ambientes em que as operações podem ser realizadas)



Validação de métodos

- Os métodos farmacopeicos ou padronizados são considerados validados.
- O laboratório deve demonstrar que os critérios de desempenho dos métodos podem ser cumpridos pelo laboratório antes de implementá-los.
- Verificação de desempenho do método e adequabilidade.
- Usar controles positivos e negativos.
- Métodos alternativos ou não compendiais devem ser validados, determinando-se os parâmetros apropriados e avaliados com ferramentas estatísticas adequadas.

Validação/verificação de métodos
 
USP <1223> Validation of alternative microbiological methods.
 
USP <1227> Validation microbial recovery from pharmacopeial articles.
 
How to meet ISO 17025 requirements for Method Verification http://www.aoac.org/aoac_prod_imis/AOAC_Docs/LPTP/alacc_g
uide_2008.pdf

 
Farmacopéia Brasileira 5ª dição (2010)   - 5.5.3.1.4 - Adequação dos métodos farmacopeicos.


Equipamentos
 
- Cada item de equipamento, instrumento ou outro dispositivo usado para teste, verificação e calibração deve ser identificado de forma exclusiva. 
- Como parte de seu sistema de qualidade, um laboratório deve ter um programa documentado para a qualificação, calibração, verificação de desempenho, manutenção e um sistema para monitorar o uso de seus equipamentos.

Calibração, verificação de desempenho e monitoramento de uso

- Dispositivos de medição de temperatura. 
- Incubadoras, banhos de água e fornos. 
- Autoclaves, incluindo preparadores de meios. 
- Pesos e balanças 
- Equipamento volumétrico 
- Outros equipamentos

Reagentes e meios de cultura
- Os laboratórios devem assegurar que a qualidade dos reagentes e meios de cultura utilizados estejam apropriados para o ensaio em questão.               
- Meios de cultura podem ser preparados internamente ou comprados parcialmente ou totalmente preparados. 
- Fornecedores de meios prontos para o uso devem ser aprovados e qualificados. O fornecedor qualificado pode certificar alguns dos parâmetros de qualidade.

Qualidade da Água

- Água com qualidade microbiológica adequada livre de substâncias bactericidas, inibidoras ou interferentes, deve ser utilizada na preparação, a não ser que o método de teste especifique de outra forma. 
 
(ISO 11133:2014   - Microbiology of food, animal feed and water
Preparation, production, storage and performance testing of culture media).


 
Controle de qualidade dos meios de cultura
O desempenho apropriado dos meios de cultura, diluentes e outras soluções devem ser verificados, quando relevante, com relação a:
- Recuperação ou a manutenção dos microrganismos-alvo. Recuperação de 50- 200% que deve ser demonstrada após a inoculação de não mais que 100 unidades formadoras de colônia (UFC).
- Inibição ou supressão de microrganismos não-alvo.
- Propriedades bioquímicas (diferenciais e diagnósticas).
- Propriedades físico-químicas e outras (por exemplo: pH,volume e esterilidade).
- Para avaliação da recuperação ou manutenção de micro- organismos deve ser dada preferência a procedimentos quantitativos.

Recuperação de Microrganismos

Testes paralelos: mesmo inóculo,      pelo mesmo técnico, em condições idênticas de incubação. Única variável é o meio.
The importance of microbiological quality control in the pharmaceutical industry Karla I. Fjeld http://pharmaphorum.com/views-and analysis/the_importance_of_microbiological_ quality_control_in_the_pharmaceutical_industry_/

 
Controle das características diferenciais
 
Características morfológicas específicas de três organismos diferentes cultivados em MacConkey Agar.
 
The importance of microbiological quality control in the pharmaceutical industry Karla I. Fjeld http://pharmaphorum.com/views-and analysis/the_importance_of_microbiological_ quality_control_in_the_pharmaceutical_industry_/
 

Resposta das culturas com microrganismos  referência

Manitol Salt Agar




Xilose Lysine Deoxycholate Agar (XLD)



Agar cetrimida



Armazenamento

- Matérias-prima, (tanto formulações comerciais desidratadas como constituintes individuais), e meios de cultura devem ser armazenados sob condições apropriadas recomendadas pelo fabricante (ambiente frio, seco e protegido da luz).
- Todos os recipientes, especialmente aqueles com meios desidratados devem ser hermeticamente fechados. Meios desidratados que se apresentem endurecidos, empedrados ou com mudança de coloração, não devem ser utilizados.

Reanimação de Microrganismos

Reanimação de microrganismos é necessária quando há possibilidade de haver células danificadas (injurias subletais).Por exemplo, por exposição a:

- efeitos prejudiciais do processamento, p.ex. calor.
- agentes antimicrobianos, conservantes, extremos de pressão osmótica, extremos de pH.

A reanimação do organismo pode ser alcançada por:

- exposição a meio líquido como uma solução salina simples à temperatura ambiente por 2 horas; 
- exposição a um meio de reparo sólido por 4-6 horas.

Materiais de referência e culturas referência

- Materiais de referência e materiais de referência certificados são geralmente usados em laboratório microbiológico para qualificar, verificar e calibrar equipamentos. 
- Sempre que possível, estes materiais de referência devem ser utilizados em matrizes apropriadas.

Padrões internacionais e substâncias de referência farmacopeicas são empregados, por exemplo, para:
 
- determinar a potência ou o conteúdo;
- validar métodos;
- permitir a comparação de métodos;
- realizar controles positivos;
- realizar testes de promoção do crescimento.

Culturas Referência

Uso de culturas de referência:
 
- desempenho de meios (incluindo kits de teste)
- para validação de métodos
- verificar a adequação dos métodos de teste
- avaliar ou avaliar o desempenho contínuo.

Rastreabilidade

Para demonstrar a rastreabilidade, os laboratórios devem usar cepas de referência de microrganismos obtidos diretamente de uma coleção nacional ou internacional reconhecida, onde estes existam.
 
Alternativamente, podem ser utilizados derivados comerciais para os quais todas as propriedades relevantes foram demonstradas pelo laboratório como equivalentes.
 
(ISO 17034:2016 General requirements for the competence of reference material producers).
 
Como usar as cepas de referência

As cepas de referência podem ser subcultivadas uma vez para fornecer estoques de referência. A verificação de pureza e bioquímica deve ser feita em paralelo, conforme apropriado. 
Recomenda-se armazenar estoques de referência emalíquotas, ultracongeladas ou liofilizadas.
 
As culturas de trabalho para uso rotineiro devem ser subculturas primárias do estoque de referência. Se os estoques de referência tiverem sido descongelados, eles não devem ser re-congelados e reutilizados.

Os estoques de trabalho normalmente não devem ser subcultivados. 

Não mais de cinco gerações (ou passagens) da linhagem de referência original podem ser subcultivadas se definidas por um método padrão ou os laboratórios podem fornecer provas documentais de que não houve alteração em nenhuma propriedade relevante. 

Derivados comerciais de estirpes de referência só podem ser utilizados como culturas de trabalho.


Esquema para uso de culturas referência
Apêndice 5





Amostragem

Quando os laboratórios de teste são responsáveis pela amostragem, é altamente recomendável que:
 
- esta seja coberta por um sistema de garantia de qualidade, 
- que seja sujeita a auditorias regulares.

Pontos importantes:

- Qualquer processo de desinfecção utilizado na obtenção da amostra não deve comprometer o nível microbiano dentro da amostra.
- O transporte e o armazenamento de amostras devem estar em condições que mantenham a integridade da amostra. Os testes devem ser realizados o mais rápido possível após a amostragem.
- Deve ser demonstrado que as condições de armazenamento, tempo e temperatura, não afetarão a precisão do resultado do teste.


Armazenamento e transporte das amostras

- As condições de armazenamento devem ser monitoradas e registros mantidos.
- A responsabilidade pelo transporte, armazenamento entre amostragem e chegada ao laboratório de testes deve ser claramente documentada.
- A amostragem só deve ser realizada por pessoal treinado.
- Deve ser realizado assepticamente usando equipamento estéril.
- No local de amostragem pode ser necessário monitorar condições ambientais, como contaminação do ar e temperatura.
- O tempo de amostragem deve ser registrado, se apropriado.


Manipulação e identificação de amostras

- O laboratório deve ter procedimentos que cubram a entrega, recebimento e  identificação das amostras. 
- Se houver problemas como amostra insuficiente ou em mau estado devido a deterioração física, temperatura incorreta, embalagem rasgada ou rotulagem inadequada, o laboratório deve consultar o cliente antes de decidir se deve testar ou recusar a amostra.

Todas as informações relevantes devem ser registradas:
 
- data e hora do recebimento.
- condição da amostra no recebimento e, quando necessário, temperatura.
- características da operação de amostragem (incluindo data e condições de amostragem).

Armazenamento das amostras após os testes

- Rótulos contaminados.
- Sub amostragem pelo laboratório imediatamente antes do teste pode ser necessária como parte do método de teste. Deve ser realizado de acordo com padrões nacionais ou internacionais ou por métodos internos validados.
- Deve haver um procedimento escrito para a retenção e eliminação de amostras. As amostras podem ser armazenadas até que os resultados do teste sejam obtidos, ou mais, se necessário.
- Descontaminação   das porções de amostra de laboratório contaminadas.

Descarte de resíduos contaminados

- Os procedimentos para a eliminação de material contaminado devem ser elaborados para minimizar a possibilidade de contaminar o ambiente. 
- É uma questão de boa gestão de laboratório e deve estar em conformidade com os regulamentos de saúde e segurança ambientais, nacionais ou internacionais.

Garantia de qualidade de resultados e controle de qualidade de desempenho

Controle interno de qualidade. 

O laboratório deve ter um sistema de garantia de qualidade interna ou controle de qualidade:
- Monitoramento dos desvios
- Uso de amostras fortificadas,
- Testes em replicatas,
- Participação em testes de proficiência. 
 
Para garantir a consistência dos resultados do dia a dia e sua conformidade com critérios definidos.
 
Procedimentos de análise

- Os testes normalmente devem ser realizados de acordo com os procedimentos descritos nas farmacopéias nacionais, regionais e internacionais. 
- Procedimentos alternativos de teste podem ser usados se forem adequadamente validados e a equivalência aos métodos oficiais for demonstrada.

Relatórios de análise

- Se o resultado da enumeração for negativo, deve ser relatado como "não detectado para uma unidade definida" ou "menor do que o limite de detecção para uma unidade definida". 
- O resultado não deve ser dado como "zero para uma unidade definida" a menos que seja um requisito regulamentar. 
- Os resultados do teste qualitativo devem ser relatados como “detectados / não detectados em uma quantidade ou volume definido”.
- Podem ser expressos como "menor que um número específico de organismos para uma unidade definida", onde o número específico de organismos excede o limite de detecção do método e isso foi acordado com o cliente. 
- Nos dados brutos, o resultado não deve ser dado como zero para uma unidade definida, a menos que seja um requisito regulamentar. 
- Um valor relatado de "0" pode ser usado para entrada de dados e cálculos ou análise de tendências em bancos de dados eletrônicos.
- Quando uma estimativa da incerteza do resultado do teste é expressa no relatório do teste, todas as limitações (particularmente se a estimativa não incluir a contribuição do componente da distribuição - aleatória, ou distribuição de Poisson - de microrganismos dentro da amostra) devem ser claras para o cliente.

Referências

World Health Organization - WHO Technical Report Series, No. 961, 2011 - Annex 2 - WHO good practices for pharmaceutical microbiology laboratories.
http://www.who.int/medicines/areas/quality_safety/quality_ assurance/GoodPracticesPharmaceuticalMicrobiologyLaborat oriesTRS961Annex2.pdf 
 
Boas práticas da OMS para laboratórios de microbiologia farmacêutica. Washington, DC: OPS, 2012. (Rede PARF Documento Técnico Nº 11)
http://apps.who.int/medicinedocs/documents/s22160pt/s221 60pt.pdf